免疫組化技術(shù)是當(dāng)今廣泛應(yīng)用的檢測(cè)組織切片內(nèi)特定蛋白的實(shí)驗(yàn)手段。利用圖像分析軟件來(lái)判讀切片圖像上蛋白表達(dá)程度是隨著軟件技術(shù)的發(fā)展逐步應(yīng)用到免疫組化技術(shù)中的。
組織上的蛋白表達(dá)程度，在圖片上表現(xiàn)為免疫染色的深淺及面積大小。用肉眼只能定性地進(jìn)行判讀，較多粗略地作一個(gè)主觀(guān)的分級(jí)評(píng)價(jià)。使用圖像分析軟件則可以對(duì)圖片染色的程度作一個(gè)定量的測(cè)量。這個(gè)測(cè)量結(jié)果與切片上的蛋白表達(dá)強(qiáng)度有理論上的線(xiàn)性相關(guān)性。所以能客觀(guān)定量地反映它。
在圖像分析的方法中，使用灰度來(lái)表示一個(gè)點(diǎn)的明暗程度，而圖片上一個(gè)點(diǎn)的明暗程度是與切片上免疫染色物的“光學(xué)密度（OD，Optical Density ）”決定的，再往下追蹤一步，就是與組織切片上這個(gè)點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度決定的。這有點(diǎn)類(lèi)似于分光光度計(jì)的情形，比色皿里液體樣品的吸光度與液體中吸光成分的濃度相關(guān)，符合朗伯-比爾定律。圖片上一個(gè)點(diǎn)的光密度則與該點(diǎn)上的蛋白表達(dá)程度正相關(guān)（近似為正比）。所以測(cè)量一個(gè)點(diǎn)的光密度值，就是在測(cè)量這個(gè)點(diǎn)上蛋白表達(dá)程度的一個(gè)相對(duì)的量值。
朗伯-比爾定律：
A為吸光度,T為透射比,是投射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度
c為吸光物質(zhì)的濃度 b為吸收層厚度
請(qǐng)注意：郎伯比爾定律中的指數(shù)關(guān)系表現(xiàn)在吸光度A與透射率T之間。吸光度A就是光密度OD。它與樣品濃度是線(xiàn)性關(guān)系。所以圖片上光密度值與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系理論上也是線(xiàn)性的。但它與灰度值之間的關(guān)系是指數(shù)的。因此，測(cè)量光密度值能更緊密地與蛋白表達(dá)程度相關(guān)，而灰度值則類(lèi)似于透光率，它與蛋白表達(dá)程度的關(guān)系是朗伯比爾定律的反向的指數(shù)關(guān)系。這就是我一再?gòu)?qiáng)調(diào)要測(cè)量光密度值的原因。
在分光光度法中，我們需要作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)定量分析樣品的實(shí)際濃度，但在組織切片的情形下，是沒(méi)法作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的。所以我們只能測(cè)量到一個(gè)相對(duì)值。能對(duì)不同點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度進(jìn)行比較，但不能測(cè)量到這個(gè)點(diǎn)的蛋白量具體是多少微克。把一片區(qū)域內(nèi)所有的點(diǎn)的光密度值累加起來(lái)，就得到一個(gè)積分光密度（IOD, Integrate Optical Density ）。 圖片上一片片的染色斑塊的深淺與范圍反映了切片上的特定蛋白表達(dá)的程度，它可以由圖片上的積分光密度來(lái)相對(duì)定量地來(lái)表示。
無(wú)論使用什么圖像分析軟件，測(cè)量原理都是一樣的。就是測(cè)量圖片上一個(gè)區(qū)域內(nèi)的黃色染色物的積分光密度。但是具體測(cè)量哪些區(qū)域的積分光密度以及較后要如何作統(tǒng)計(jì)分析，就不是一個(gè)簡(jiǎn)單的圖像分析問(wèn)題了，而是與研究目標(biāo)密切關(guān)聯(lián)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)問(wèn)題。這也就是我無(wú)法說(shuō)出該選擇什么樣的測(cè)量區(qū)域來(lái)計(jì)算區(qū)域面積與區(qū)域內(nèi)光密度值的原因。我只能總結(jié)出一個(gè)規(guī)律，就是要計(jì)算一個(gè)平均光密度指標(biāo)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組樣品與對(duì)照組樣品的統(tǒng)計(jì)比較。也就是計(jì)算出測(cè)量區(qū)域內(nèi)的積分光密度值，然后對(duì)這個(gè)區(qū)域的面積進(jìn)行平均。以這個(gè)平均光密度值作為統(tǒng)計(jì)比較的依據(jù)。
示例：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇的測(cè)量指標(biāo)：
直接比較整張圖片的積分光密度值。實(shí)際上測(cè)量面積就是整張圖片的面積。
比較特定區(qū)域的平均光密度值。在一張圖片上有許多區(qū)域的時(shí)候，可以只抽取其中部分試樣來(lái)測(cè)量的。這影響到的是抽樣量。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)盡可能地測(cè)量圖片上全部應(yīng)當(dāng)測(cè)量的區(qū)域。
同一張圖片上不同的區(qū)域之間進(jìn)行比較。這時(shí)候一張圖片上能得到一對(duì)數(shù)據(jù)，全部樣品測(cè)量數(shù)據(jù)可以作配對(duì)T-檢驗(yàn)。
測(cè)量圖片上一個(gè)特定區(qū)域內(nèi)的平均光密度。注意選擇測(cè)量區(qū)域的時(shí)候，選得不太準(zhǔn)不要緊，這仍然是個(gè)抽樣的問(wèn)題，它對(duì)平均光密度值的影響是很小的。
測(cè)量區(qū)域就是染上了顏色的細(xì)胞，此時(shí)在測(cè)量黃色的IOD值的時(shí)候能同時(shí)測(cè)量出面積來(lái)。不必另外去選擇測(cè)量區(qū)域。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以有多種測(cè)量指標(biāo)供選擇：每個(gè)細(xì)胞的面積，積分光密度，平均光密度，照片上的細(xì)胞數(shù)量（其實(shí)就是細(xì)胞密度）等等。
在整個(gè)分析過(guò)程中，一般每張圖片測(cè)量出的只是一個(gè)平均光密度值，作為一個(gè)測(cè)量數(shù)據(jù)。一張切片則需要拍攝多張照片，這些照片各自的光密度平均值平均之后可以作為這張切片的測(cè)量數(shù)值。一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品又可能會(huì)制作多張切片，所以較終一個(gè)樣品（一塊組織，一個(gè)動(dòng)物，一個(gè)病例等）的測(cè)量數(shù)據(jù)就是所有這些照片的平均光密度值的平均值。在兩組實(shí)驗(yàn)樣品的統(tǒng)計(jì)處理中，就是把每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的所有照片的平均光密度值再作一次平均，作為該樣品的測(cè)量數(shù)值。一組樣品的測(cè)量值再計(jì)算其平均值與標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)細(xì)胞核上蛋白的免疫組化測(cè)量有其特殊性。如果蛋白只在細(xì)胞核上表達(dá)，則不需要對(duì)核作藍(lán)染，切片上只有細(xì)胞核上有黃色染色物。可以直接進(jìn)行分析測(cè)量。
在更多的情況下，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)染是必須的。只有染上藍(lán)色才能判斷細(xì)胞核的區(qū)域。但同時(shí)，藍(lán)染對(duì)細(xì)胞核的光密度測(cè)量造成了嚴(yán)重干擾。會(huì)導(dǎo)致光密度測(cè)量值的極大誤差。這時(shí)候用肉眼主觀(guān)判斷與圖像分析測(cè)量的結(jié)果基本上沒(méi)啥區(qū)別了。一個(gè)主觀(guān)的定量方法就是用肉眼判斷陽(yáng)性細(xì)胞核與陰性細(xì)胞核，然后計(jì)數(shù)其比例作為一個(gè)定量的測(cè)量值。但這只適用于切片上有兩類(lèi)細(xì)胞的情況。測(cè)量細(xì)胞核上的免疫組化圖片需要從染色開(kāi)始就要考慮其分析測(cè)量過(guò)程。過(guò)程會(huì)比較復(fù)雜。這也相當(dāng)于一個(gè)實(shí)驗(yàn)方法的研究課題了。
關(guān)于使用熒光染料染色的熒光照片，使用圖像分析方法測(cè)量其熒光強(qiáng)度是不被提倡的。這并不是因?yàn)閳D像分析軟件測(cè)量不了圖片的光密度，而是因?yàn)樵跓晒鈭D片的拍攝過(guò)程中，完全不能把切片的熒光強(qiáng)度正確地表現(xiàn)到圖片的光密度上。較終的定量分析結(jié)果恐怕還不如鏡下目視的判斷結(jié)果準(zhǔn)確。
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